همه چیز درمورد سلول RNA
تکثیر microRNA به کمک Real-time PCR یکی از پر کاربردترین تکنیک ها در حوزه تحقیقاتی microRNA می باشد. اساس این تکنیک مشابه روش های معمولی Real-time PCR می باشد، با این تفاوت که به واسطه کوچکی اندازه microRNA ها راهکارهای خاصی برای این منظور ارایه شده است.
افزودن یک دم polyA به miRNAهای مورد نظر یکی از این شیوه هاست که در کیت PARSGENOME MiR-Amp kit نیز از همین روش برای تکثیر miRNAها استفاده شده است.
استخراج RNA یکی از مراحل اساسی در اکثر تحقیقات انجام شده در زمینه miRNA است. روش های متفاوتی برای استخراج RNA تام وجود دارد اما فقط برخی از آن ها می توانند RNA های کوچک مولکول را حفظ کرده و استخراج نمایند.
دستورالعمل زیر توسط تیم تحقیقاتی ما برای استخراج RNA تام حاوی miRNA بهینه سازی و آزموده شده است. این دستورالعمل برای محلول های استخراج با پایه گوانیدین ایزوتیوسیانات- فنل: کلروفرم قابل استفاده است.
استخراج RNA به منظور تخلیص RNA از نمونه‌های سلول و بافت انجام میشود. این روش به واسطه‌ی حضور آنزیم های ریبونوکلئاز بسیار سخت و پیچیده است، به همین منظور توصیه میشود قبل از شروع کار همه‌ی وسایل با محلول‌های خنثی کننده‌ی RNase ,DEPC شستشو داده شده و تمامی مراحل با دستکش زیر هود انجام شود.
RNA چیست ؟
تمام انواع حیات پیشرفته (ارگانیسم های مختلف) بر روی زمین از سه نوع متفاوت از مولکول های زیستی برای انجام هر کدام از فعالیت های حیاتی درون سلول هایشان استفاده می کنند.
پروتئین ها نقش های مختلفی در سلول ها دارند مثل نقش ساختاری، نقش جا به جا کننده مواد شیمیایی در سلول و یا پیش برنده فعالیت های گوناگون کاتالیزوری، در صورتیکه اسیدهای نوکلئیک، DNA و RNA حامل اطلاعات ژنتیکی هستند و می توانند از نسلی به نسل دیگر به ارث برده شوند.
RNA که مخفف ribonucleic acid (اسید ریبونوکلئیک) است، یک مولکول پُلیمری است که از یک یا چند نوکلئوتید ساخته شده است. یک رشته RNA را می توان به شکل یک زنجیره تصور کرد که در هر محل اتصال از زنجیر یک نوکلئوتید قرار دارد.
هر نوکلئوتید بر پایه (آدنین، سیتوزین، گوانین و اوراسیل که به اختصار A,C,G,U نامیده می شوند)، یک قند ریبوز و فسفات ساخته می شود.
روش های استخراج RNA
چندین روش برای استخراج RNA وجود دارد که در زیر به بخشی از آن اشاره می شود:
1. روش فنل _ کلروفرم ۱
چندین روش برای استخراج RNA وجود دارد که مهمترین آن فنل _ کلروفرم است. این روش، استخراج مایع – مایع بوده که برای خالص سازی اسیدهای نوکلئیک، حذف پروتئین‌ها و لیپیدها کاربرد دارد.
2. روش فنل _ کلروفرم ۲
در این روش بافت های هموژن، سلول‌های لیز شده و نمونه‌های محلول با حجم مساوی از فنل و کلروفرم ترکیب شده، پس از سانتریفوژ دو فاز مجزای آبی و آلی شکل می‌گیرد.
پروتئین و لیپیدهای هیدروفوب در فاز آلی پایینی قرار می‌گیرند و در فاز آبی (بالایی) اسیدهای نوکلئیک و سایر آلاینده ها مانند نمک، قند و… قرار دارند. هنگام پیپت کردن و جداسازی فاز آبی باید نهایت دقت صورت گیرد تا از فاز آلی، خصوصا قسمت فوقانی آن که حاوی پروتئین است وارد فاز آبی نشود.
3. روش فنل _ کلروفرم ۳
مقدار PH محلول برای خالص سازی RNA از DNA تعیین کننده است. در شرایط اسیدی DNA به فاز آلی انتقال می‌یابد و RNA در فاز آبی می ماند، در شرایط بازی هر دو در فاز آبی باقی خواهند ماند.
4. روش فنل _ کلروفرم ۴
با استفاده از ایزوپروپانول، RNA رسوب داده می شود و در مرحله‌ی آخر با اتانول ۷۰%-۸۰% شستشو و خالص‌سازی صورت می‌گیرد. در نهایت رسوب حاصل از RNA در حجم معینی از آب فاقد RNase حل میشود.
تفاوت میان RNA و DNA
ساختار نوکلئوتیدهای RNA بسیار شبیه ساختار نوکلئوتیدهای DNA هستش با یک تفاوت اصلی که اسکلت ساخته شده از قند ریبوز RNA گروه هیدروکسیل (-OH) دارد ولی اسکلت DNA فاقد این گروه است.
علت نام گذاری اختصار DNA هم همین تفاوت در قند ریبوز است deoxyribonucleic acid دئوکسی‌ریبونوکلئیک اسید. تفاوت اصلی دیگر این است که DNA از بازِ تیمین (T thymine) به جای اوراسیل (U) استفاده می کند. بر خلاف شباهت بسیار زیاد ساختاری DNA ،RNA در سلول های پیشرفته، نقش های متفاوتی ایفا می کنند.
در مسیر تبدیل DNA به پروتئین که به عنوان اصل مرکزی زیست مولکولی (اصل دگما سنتر) شناخته می شود، RNA نقش اصلی را بازی می کند. اطلاعات ژنتیکی موجودات زنده به شکل یک خط متوالی از بازها در DNA موجود در سلول رمز گزاری می شوند.
در طی فرایند رونویسی (گام اول از فرایند بیان ژن)، یک RNA که یک کپی از DNA است، یا یک RNA حمل کننده پیام (پیامبر)، ساخته می شود. این رشته RNA می تواند توسط ریبوزوم خوانده شده و پروتئین را به وجود بیاورد.
همچنین RNA ها نقش مهمی در سنتز پروتئین (در بخش ریبوزیم) و تنظیم ژن ایفا می کنند. پیچ و تاب خوردن RNA به واسطه تعاملات بازها برای جفت شدن با یکدیگر در مناطق مختلفی از تک رشته RNA رخ می دهد.
این انیمیشن نشان می دهد که به صورت یک مدل تئوری چگونه این پیچ و تاب خوردگی می تواند رخ دهد. ساختار نشان دهده شده کلاس 1 RNA لیگاز (PDB #1QXI ) است که توسط گروه Bartel در MIT جدا شده است.
تفاوت اصلی دیگر بین RNA و DNA این است که عموما DNA در شکل دو رشته به هم تابیده در سلول وجود دارد، در حالی که RNA معمولا به شکل یک رشته تکی دیده می شود (شکل بالا). عدم وجود یک جفت رشته به RNA اجازه می دهد که به ساختارهای پیچیده ای سه بعدی به اطراف خود پیچ و تاب بخورد.
پیچ و تاب خوردن RNA به واسطه همان تعامل باز، بازی رخ می دهد که در DNA هم دیده می شود، با این تفاوت که در مورد RNA پیوند ها به واسطه یک رشته شکل می گیرید در صورتی که در مورد DNA این پیوند ها به واسطه دو رشته به وجود می آید.